Связаться с нами
+7 (495) 995 50 30 (Москва) 8 (800) 550 29 46 (Россия)

звоните круглосуточно!

Кафедра анатомии, физиологии животных и хирургии

Российский университет дружбы народов

Ул. Миклухо-Маклая, 8/2, 117198. Москва, Россия

 

Работа посвящена изучению биохимических и морфологических характеристик крови в условиях гиповолемии при множественной травме тазовых конечностей у собак.

В статье представлен системный подход к изучению процессов происходящих в организме собак под воздействием посттравматической гиповолемии. Проведены исследования динамики биохимических, гематологических изменений в организме, даны подробные характеристики структуры эритроцитов в острый посттравматический период. Представлена зависимость морфологических характеристик эритроцитов от степени уменьшения объема циркулирующей крови и уровня некоторых метаболитов сыворотки крови. Установлено, что развитие преренальной недостаточности, повышение мочевины и креатинина, возникающие при острой гиповолемии, способствует изменению структуры и функции эритроцитов, что в свою очередь усугубляет гипоксию тканей и органов.

 Структурная и функциональная составляющая органной патологии, развивающаяся под воздействием острой механической травмы у животных, является актуальной проблемой ветеринарной медицины, так как увеличение удельного веса травматизма среди незаразной патологии мелких домашних животных отмечено в публикациях ведущих специалистов данной области. Развитие ряда осложнений в острый посттравматический период, таких как посттравматическая анемия, гиповолемия, нарушение гемодинамики и микроциркуляции значительно снижает устойчивость тканей к инфекции, способствует развитию интоксикации, усложняют течение посттравматического периода. Развитие гиповолемии создает условия для централизации кровообращения, кислородного голодания паренхиматозных органов (Rahgozar M, Willgoss DA, et al., 2003; Gueler F, Gwinner W, Schwarz A, 2004; Bonventre JV, 2004). Красные клетки крови чрезвычайно чувствительны к любым изменениям в системе гомеостаза, нормальное функционирование эритроцитов возможно только в условиях поддержания оптимальной формы и размера клеток. Изучение изменений структуры эритроцитов под влиянием посттравматической гиповолемии у спонтанно травмированных собак представляет особый интерес, так как эритроцит является непосредственным участником кислородного обеспечения тканей. В этой связи, целью наших исследований явилось, выявление взаимосвязи между изменениями морфологии эритроцитов в условиях нарушения метаболизма, тканевого распада и перераспределения жидкости, происходящих при травматической болезни, и биохимическими показателями сыворотки крови, характеризующих экскреторную способность почек, в условии гипоксии органа.

Материалы и метод

Работу проводили на кафедре анатомии, физиологии животных и хирургии РУДН и в ветеринарной клинике «Центр» (г. Москва). Для исследования использовали собак в количестве – 41 особи, в возрасте от 1,3 до 3-х лет, с живой массой 16-22 кг, содержащихся на стандартном концентрированном рационе. Животные поступали на прием после дорожно-транспортных происшествий в период 2005-2008 годов, с множественными переломами тазовых конечностей. В качестве контроля физиологических, гематологических, биохимических параметров использовали данные собственных исследований на 8-ми клинически здоровых собаках. Исследуемые животные были разделены на 3 группы по степени нарушения объема циркулирующей крови (ОЦК), на момент поступления, на прием - на 1-2 сутки после травмы.

Оценка степени нарушения циркуляторного русла проводилась по методу Филипса-Ван Слайка, в модификации Г.А. Барашкова. В 1-ую группу вошли животные с нарушением ОЦК 5-10% (n=19), во 2-ую – 11-20% (n=14) и 3-ю группу составили собаки с нарушением ОЦК 21-40% (n=8). Все исследования проводили в предоперационный стабилизационный период. Количество животных участвующих в эксперименте уменьшалось за счет особей выбывающих по причине эвтаназии и животных, прооперированных после стабилизации физиологических и лабораторных показателей. Комплексный методический подход включал в себя изучение гематологических показателей, с определением морфологии эритроцитов, и биохимического состава сыворотки крови.

Для гематологических исследований забор крови производили с использованием пластиковых пробирок объемом 2,0 мл, содержащих ЭДТА в качестве антикоагулянта. Клинический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе «ABC Vet User Manual», с подсчетом гемограммы и оценкой морфологии клеток крови. Для микроскопии использовали микроскоп «OLYMPUS» BX – 51 с цифровой камерой.

Для биохимических исследований использовали вакуумные пробирки (пластиковые пробирки Vacutainer объемом 3мл). Исследования цельной крови проводили спустя 0,5-2 часа после взятия. Сыворотку крови получали методом отстаивания цельной крови и ретракции кровяного сгустка с последующим центрифугированием при 2000 об\мин в течение 10-15 минут. Не использовали гемолизированные и хилезные образцы. Биохимический состав сыворотки крови исследовали на анализаторе «Humalizer Junior» фирмы Human. Определение концентрации мочевины уреазным методом (J.K.Fawcell et al., 1960; A. Tobacco et al., 1979).

Принцип метода заключается в том, что мочевина гидролизуется в присутствии воды и уреазы с образованием аммония и диоксида углерода. По модифицированной реакции Бертелота ионы аммония реагируют с гипохлоритом и салицилатом с образо­ванием зеленой окраски. Увеличение поглощения реакционной смеси при длине волны 578 нм пропорцио­нально концентрации мочевины в пробе. Определение концентрации креатинина проводили кинетическим методом по реакции Яффе (Barteis, 1971; Schirmeister, J. et al., 1964). Принцип метода. Фотометрический тест по конечной точке. Метод с депротеинизацией. Креатинин взаимодействует с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием комплекса желто-оранжевого цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса пропорциональна концентрации креатинина в пробе.

При исследовании структурной и функциональной активности эритроцитов использовали стандартную методику исследования крови в модификации В.В. Долгова с соавт. (2001). Мазки крови, окрашивали по Романовскому–Гимза. Статистическую обработку данных проводили по Стьюденту с использованием программного обеспечения РС MS Exсel 2003.

Результаты исследования

Анализ полученных результатов продемонстрировал изменения периферической крови, в первой опытной группе, в ответ на стресс-фактор от травмы и наличие болевого синдрома. Максимальное снижение концентрации гемоглобина (в 1,54 раза), гематокрита (в 1,97 раза) и количества эритроцитов (в 1,43 раза) мы наблюдали на 3-и сутки после травмы. Полученные нами данные сопоставимы с данными литературных источников (Долгов В.В., 2001), в том, что в 1-2 сутки уменьшение гемоглобина и гематокрита лишь опосредованно могут характеризовать величину кровопотери.

При исследовании в 1-й группе метаболитов сыворотки крови, мы установили, что отклонения в содержании мочевины и креатинина у собак с нарушением ОЦК 5-10% не были достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных (табл. 1). Максимальное изменение концентрации мочевины наблюдалось на 2-е сутки после травмы (увеличение на 53%), что является следствием, как пассивной резорбции мочевины, так и возросшего ее синтеза из аминокислот, освобождаемых в результате повреждения тканей. Изменения концентрации креатинина, вообще имели тенденцию к уменьшению (на 47%), что, по нашему мнению, является реакцией на потерю белковой составляющей крови, при сохраненной функции почек.  

Оценивая структурные особенности эритроцитов, мы установили, что количество нормоцитов, в 1-й опытной группе, сократилось на 21%, из-за роста процентного соотношения красных кровяных клеток большего размера (макроцитов). Количество макроцитов увеличивается в результате индуцированного ответа костного мозга на кровопотерю за счет выхода в кровяное русло большого количества незрелых эритроцитов (ретикулоциты, ядерные эритроциты, эритроциты с тельцами Жолли), с не полностью гемоглобинизированной цитоплазмой и остатками ядерной РНК. Вследствие этого, в группе с уменьшением ОЦК на 5-10%, мы наблюдали, значительное преобладание макроцитарного звена и соответственно уменьшение за счет этого количества микроцитов и нормоцитов, что подтверждается работами Черткова И.Л., Гуревича О.А. (1984); Алексеева Н.А. (2004). Увеличение макроцитарного звена, направленное на быстрое восполнение количества эритроцитов периферической крови, тем не менее, не уменьшает гипоксические процессы в организме, поскольку красные кровяные клетки, не имеющие достаточной насыщенности гемоглобином, не способны полноценно осуществлять процессы газообмена в тканях и органах.

Таблица1
Динамика эритроцитарных и биохимических показателей в условиях гиповолемии с уменьшением ОЦК на 5-10%

 

Показатель

ИД

(n-8)

1 день

(n-19)

3 день

(n-12)

5 день

(n-9)

Гемоглобин (г/дл)

151,00±2,80

101,00±3,00*

98,00±2,70*

104,00±3,10*

Гематокрит (%)

45,20±1,70

31,00±3,10*

22,90±2,70*

26,10±1,90*

Эритроциты (10 12/л)

151,00±2,80

101,00±3,00

98,00±2,70

104,00±3,10

Нормоциты (%)

75,0±5,2

62,0±4,2

64,7±3,7

65,5±6,1

Дискоциты (%)

99,20±8,6

94,8±8,7

92,4±6,8

94,3±7,8

Ретикулоциты (%)

3,0±0,15

11,2±1,1*

15,2±1,4*

13,5±1,2*

 

Креатинин (мкмоль\л)

87,00±19,00

46,00±5,40*

88,00±20,10

86,00±16,40

Мочевина (ммоль\л)

8,10±1,90

8,60±1,60

11,40±2,20

9,90±1,90

Примечание.

Достоверность разницы по отношению к контролю: * - Р<0,05;

Отклонения, наблюдаемые со стороны изменения формы эритроцитов в 1-й группе, так же были мало значимыми. Достоверная разница с группой контрольных животных наблюдалась только в содержании ретикулоцитов. Увеличение красных кровяных клеток, содержащих остатки ядерной РНК, объясняется выбросом костным мозгом незрелых эритроцитов, что является физиологической реакцией на кровопотерю. В крови здоровых животных большинство эритроцитов представлено – дискоцитами (99,2%), позволяющей им оптимально выполнять свою функцию по переносу кислорода и углекислого газа.

До 10% циркулирующих эритроцитов могут быть с незначительно измененной формой (эхиноциты, стоматоциты) и только серьезные изменения гемодинамики приводят к появлению таких морфологических форм эритроцитов, как сфероциты, шизоциты, мишеневидные эритроциты, монетные столбики, акантоциты. Акантоциты и мишеневидные клетки, форма которых изменяется за счет токсического воздействия продуктов метаболизма и азотистого обмена на белки мембраны клетки, изменяя ее проницаемость, в 1-й группе составили от 0,8% до 6,1%. Как видно из табл. 2, травматическое воздействие и кровопотеря у животных 1 и 2-й групп, повлекло падение концентрации гемоглобина в 1,5 и 1,7 раза, эритроцитов в 1,5раза, показателя гематокрита в 1,45 и 1,8раза. В этот период, объем крови восполняется за счет поступления в сосуды тканевой жидкости. Вследствие разжиже­ния крови, повышенного износа и разрушения эритроцитов количество их снижается.

Возникшая постгеморрагическая анемия относится к анемиям регенера­торным, так как с 4—5-го дня после кровопотери начинается интенсив­ная продукция эритроцитов под влиянием эритропоэтина и продуктов распада эритроцитов. В костном мозге увеличивается содержание эритро - и нормобластов. В периферической крови обнаруживаются клетки физиологической регенерации: увеличивается количество ретикулоцитов, полихроматофилов, появляются нормобласты.

Изменения концентрации мочевины и креатинина во 2-й опытной группе характеризовались более значимыми различиями по сравнению с данными контрольной группы. Содержание креатинина в сыворотке крови снижено в первые сутки наблюдения на 67%, затем на 2-е, 3-е и 5-е сутки содержание креатинина увеличено на 85%, 71%, 46% по отношению к исходным данным (ИД). Содержание мочевины увеличивается на 2-е, 3-е и 5-е сутки наблюдения вместе с ростом креатинина в 2,4; 1,4 и 1,2 раза. Повышение метаболитов сыворотки крови (мочевины и креатинина) во 2-й исследовательской группе имеют более значимое выражение, чем в 1-й группе и имеют достоверный характер изменений на 2-е, 3-и сутки после травмы.

Падение плазменного онкотического давления, возникающее в ответ на кровопотерю, приводит к интенсивному вытеснению жидкости в интерстициальное пространство. Снижение кровоснабжения почек, возникающее при централизации кровоснабжения, является нормальной физиологической реакцией организма и приводит к замедлению фильтрационных процессов в почках, уменьшению мочеобразования, увеличению в крови концентрации натрия и мочевины. Это состояние определяется как преренальная почечная недостаточность. Длительная гипоксия почечной ткани и азотемия приводят к дистрофическим и некротическим изменениям клубочкового и канальцевого аппарата и, как следствие, к ренальной почечной недостаточности. Таким образом, мы считаем, что при гиповолемии 11-20%, рост концентраций мочевины и креатинина свидетельствует о возможности поражения клубочкового аппарата почек.    

Таблица 2

Динамика эритроцитарных и биохимических показателей в условиях гиповолемии с уменьшением ОЦК на 11-20%

 

 

ИД

(n-8)

1 день

(n-14)

2 день

(n-12)

3 день

(n-6)

5 день

(n-5)

Гемоглобин (г/дл)

151,00±2,80

89,00±2,00*

91,0±1,0*

99,00±1,00*

105,00±2,0*

Гематокрит (%)

45,20±1,70

21,80±0,80*

24,50±1,50*

24,90±0,90*

26,00±1,80*

Эритроциты (10 12/л)

5,90±2,50

3,40±1,50

3,90±1,50

4,20±1,50

4,90±1,20

Нормоциты (%)

75,0±5,2

61,4±5,9*

61,2±4,5*

57,0±4,5*

61,1±6,0*

Дискоциты (%)

99,20±8,6

91,8±7,9

90,6±8,7

91,9±8,9

95,2±8,7

Ретикулоциты (%)

3,0±0,15

11,2±1,1*

15,4±1,95*

13,8±1,27*

12,4±1,09*

 

Креатинин мкмоль\л)

87,00±19,00

58,00±16,4

161,0±18,0*

149,00±17,80*

127,0±20,7

Мочевина (ммоль\л)

8,10±1,90

6,6±2,1

19,40±2,80*

11,50±2,10

9,80±1,90

             

 Примечание: достоверность разницы по отношению к контролю: * - Р<0,05;

Количество нормоцитов, неуклонно снижается во 2-й и особенно в 3-й группе (табл.3). Максимальное снижение мы наблюдали на 3-и сутки на 24% и 30,4% от ИД. Достоверные различия в количестве нормоцитов, во 2-й опытной группе собак, мы констатировали весь период наблюдения. Это говорит о том, что в группе животных с уменьшением ОЦК 11-20%, имеются существенные отклонения от нормального, оптимального для физиологических процессов в организме, размера красных кровяных клеток. Во 2-й и в 3-й группах отмечен рост процентного соотношения как макроцитарного, так и микроцитарного звена.

Макроцитарное звено составляют незрелые эритроциты с остатками ядер в виде телец Жолли, колец Кебота, азурофильной зернистости, большего размера и ненасыщенной гемоглобином цитоплазмой. Микроцитарное звено составляю эритроциты меньшего размера, с дефектами мембраны и цитоплазмы, укороченным периодом жизни. По нашему мнению уменьшение жизни эритроцитов происходит как ответ на возникающую преренальную уремию и в результате токсического воздействия продуктов воспалительных реакций, связанных с увеличением белков острой фазы. Процентное соотношение акантоцитов и мишеневидных эритроцитов во 2-й группе увеличилось до 7,7%, по сравнению с данными контрольной группы. На наш взгляд, изменения формы и нарушение проницаемости мембраны эритроцитов - результат токсического влияния на клетки продуктов метаболизма, которые способствуют мембранолитическим процессам. Значительная кровопотеря и шоковое состояние органов могут привести к перераздражению костномозгового кроветворения, угнетению эритропоэза, нарушению метаболизма железа и развитию анемии.

В 3-й группе животных (табл. 3) мы установили самые низкие показатели красной крови. Показатели гемоглобина, гематокрита и количества эритроцитов были максимально снижены на 1-2 сутки и составили 57,6%; 43,6%; 54,2% соответственно, по сравнению с данными контрольной группы собак. Это происходит из-за губительного воздействия на эритроциты продуктов азотистого обмена, так как содержание мочевины и креатинина у собак этой группы превышало ИД в среднем в 3,4 для мочевины и в 2,9 для креатинина, соответственно, присутствующих в крови из-за недостаточного кровоснабжения почек и перераспределения ОЦК.

Более значимое, в процентном соотношении, увеличение концентрации мочевины в сыво­ротке крови животных 3 группы, по сравнению с концентрацией креатинина, является, следствием, помимо нарушения фильтрационной способности почек, как пассивной реабсорбции моче­вины, так и возросшего ее синтеза из аминокислот, освобождаемых в результате повреждения тканей. За счет выхода плазмы из интерстициального пространства значения гематокрита восстанавливаются быстрее, чем значения эритроцитов и гемоглобина. К 5-м суткам после травматического воздействия гематокрит в опытной группе, был в 2 раза меньше соответствующего значения контрольной группы, а гемоглобин и количество эритроцитов в 1,6 раза и в 1,5 раза соответственно.

По данным Л.Ю. Карпенко (2002), анемия характерный признак всех периодов преренальной и ренальной ОПН. Помимо кровопотери при травме на содержание эритроцитов, концентрацию гемоглобина, гематокритное число могут оказывать влияние патологическое депонирование крови, экстраваскулярная транслокация жидкости, характер и темпы инфузионно-трансфузионной терапии, объем и скорость диуреза. (Шанин Ю.А. Кострюченко А.Л., с соавт., 1978).

Таблица 3

Динамика эритроцитарных и биохимических показателей в условиях гиповолемии с уменьшением ОЦК на 21-40%

Показатель

ИД

(n-8)

1 день

(n-8)

2 день

(n-7)

3 день

(n-7)

5 день

(n-5)

Гемоглобин (г/дл)

151,00±2,80

87,00±2,10*

88,00±1,40*

85,00±2,00*

94,00±2,00*

Гематокрит (%)

45,20±1,70

20,30±1,80*

19,70±1,60*

21,10±1,90*

23,40±1,80*

Эритроциты (10 12/л)

5,90±2,50

3,20±1,80

3,20±1,50

3,50±1,70

3,90±1,60

Нормоциты (%)

75,0±5,2

60,3±6,1*

59,1±4,5*

52,2±3,5*

57,7±6,8*

Дискоциты (%)

99,20±8,6

88,8±7,8

85,2±7,8

88,2±7,6

92,3±7,8

Ретикулоциты (%)

3,0±0,15

12,2±1,68*

15,4±1,84*

14,5±1,5*

12,4±1,3*

 

Креатинин (мкмоль\л)

87,00±19,00

97,0±21,20

275,0±23,0*

221,0±25,20*

181,0±29,40*

Мочевина (ммоль\л)

8,10±1,90

10,60±1,70

29,40±3,10*

24,50±2,50*

29,80±1,60*

Примечание: достоверность разницы по отношению к контролю: * - Р<0,05;

В 3-й опытной группе продолжалось снижение количества нормоцитов за счет роста процентного соотношения микроцитов. Количество клеток, мембрана которых подверглась губительному воздействию повышенного содержания мочевины в крови (акантоциты и мишеневидные эритроциты), в этой группе возросло до 8,1%. Кроме того, в первые 2-е суток после спонтанной травмы в крови, появлялись агрегаты эритроцитов - сладж-синдром. Причиной агрегации которых, стали нарушения состава плазмы крови в результате поступления продуктов распада тканей, гемолитические нарушения и повреждение мембраны эритроцитов. На этот счет А. В. Папаян (1974) высказал предположение, что неполная блокада капилляров и артериол фибрином повреждает эритроциты механически. В мазках крови в таких случаях выявляются фрагментированные разрушенные и слипшиеся эритроциты, и сфероциты («скорлупки»).

Таким образом, в проведенных нами исследованиях, установлено, что посттравматическая гиповолемия способствует повышению в крови продуктов азотистого обмена, уровень нарушения почечной фильтрации коррелирует со степенью понижения объема циркулирующей крови. Изменения морфологических характеристик эритроцитов возникают за счет гипоксии и губительного действия повышенного содержания мочевины в крови, в тоже время, эритроциты, не имеющие оптимальную дисковидную форму, полноценно не участвуют в процессе газообмена и, как следствие, усугубляют состояние посттравматической гипоксии тканей. Изменения структуры эритроцитов в период посттравматической гиповолемии у спонтанно травмированных собак возникают по причине развивающейся преренальной уремии и в результате токсического воздействия продуктов воспалительных реакций, увеличение количества структурных нарушений эритроцита находится в коррелятивных связях с биохимическими показателями сыворотки крови.

 

English Изменения структуры эритроцитов под влиянием посттравматической

гиповолемии у собак.

 

Бажибина Е.Б.

Кафедра анатомии, физиологии животных и хирургии

Российский университет дружбы народов

Ул. Миклухо-Маклая, 8/2, 117198. Москва, Россия

 

Работа посвящена изучению биохимических и морфологических характеристик крови в условиях гиповолемии при множественной травме тазовых конечностей у собак. В статье представлен системный подход к изучению процессов происходящих в организме собак под воздействием посттравматической гиповолемии. Проведены исследования динамики биохимических, гематологических изменений в организме, даны подробные характеристики структуры эритроцитов в острый посттравматический период. Представлена зависимость морфологических характеристик эритроцитов от степени уменьшения объема циркулирующей крови и уровня некоторых метаболитов сыворотки крови. Установлено, что развитие преренальной недостаточности, повышение мочевины и креатинина, возникающие при острой гиповолемии, способствует изменению структуры и функции эритроцитов, что в свою очередь усугубляет гипоксию тканей и органов.

 

Литература.

  1. Абрамов М.Г. Гематологический атлас. –2-е изд. – М.: 1985. – 344с.
  2. Алексеев Н.А. Анемии. – СПб.: Гиппократ, 2004. – 512 с.
  3. Долгов В.В. Лабораторная диагностика анемий: Пособие для врачей / В.В. Долгов, С.А. Луговская, В.Т. Морозова, М.Е. Почтарь. – Тверь: Губернская медицина. - 2001. – 88 с.
  4. Карпенко Л.Ю. К вопросу о патогенезе анемии при заболеваниях почек у собак //Ветеринарная практика. – 1998. - №3(6). – с. 4-6.
  5. Папаян А.В., Валькович Э.И. Гемолитико-уремический синдром у детей// Здравоохр. Белоруссии. 1976. - №3. – с. 19-22.
  6. Переверзев А.Е. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс- факторы. – Л.: Наука,. - 1986. – 172 с.
  7. 7. Шанин Ю. Н., Шанин В. Ю., Цыган В. Н. // Общая патология боевой травмы / Под ред. Ю. Л. Шевченко. - СПб. - 1994. - С. 17-36.
  8. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Пер. с англ. – М. – СПб.: Изд.БИНОМ – «Невский диалект». - 2000. – 448с.
  9. Gueler F, Gwinner W, Schwarz A, Haller H: Long-term effects of acute ischemia and reperfusion injury. Kidney Int. - 2004. – vol. – 66. – p. 523 –537,.
  10. Rahgozar M, Willgoss DA, Gobe GC, Endre ZH: ATP-dependent K+ channels in renal ischemia reperfusion injury. Ren Fail. – 2003. – 25. – p. 885 –896.